Kit de PCR directa de tejido de ratón

Amplificación rápida del gen diana directamente a partir de muestras de tejido animal sin extracción.

El kit Mouse Tissue Direct PCR adopta un diseño de empaque exclusivo que incluye todos los reactivos para la preparación rápida del ADN genómico y la amplificación por PCR. Es aplicable para la purificación del ADN del genoma en un solo paso a partir de tejidos de ratón (cola, oreja y dedo del pie) y la posterior amplificación y detección por PCR. Todo el proceso no incluye homogeneización, trituración, digestión durante la noche, extracción con solvente orgánico, precipitación con etanol o etapas de purificación en columna. Se pueden obtener resultados estables con operaciones simples y rápidas.

El 2 × Dir PCR MasterMix proporcionado por este kit es un reactivo de PCR altamente compatible que puede amplificar el ADN de manera eficiente y específica sin la necesidad de eliminar impurezas como las proteínas. Este reactivo contiene un arranque en caliente modificado con anticuerpo.Taq ADN polimerasa, dNTP, MgCl₂, tampones, así como el potenciador, optimizador y estabilizador para la reacción de PCR. La reacción de PCR se puede realizar simplemente agregando una plantilla extraída aproximadamente y cebadores específicos. Todo el proceso es rápido, simple, sensible, específico y estable, lo que es especialmente adecuado para el cribado de alto rendimiento. El 2 × Dir PCR MasterMix contiene un tinte de electroforesis premezclado, de modo que los productos de PCR se pueden enviar directamente para la detección de electroforesis después de la reacción. El extremo 3 'del producto de PCR tiene una cola A, que puede usarse para la clonación de TA.

Gato. No	Tamaño de embalaje
4992531	20 µl × 50 rxn
4992532	20 µl × 200 rxn

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Detalle del producto

Flujo de trabajo

Ejemplo experimental

Preguntas más frecuentes

Etiquetas de productos

Características

■ Sencillo y rápido: el ADN genómico se puede extraer rápidamente de los tejidos del ratón en 60 minutos sin trituración de nitrógeno líquido ni extracción con disolventes orgánicos.
■ Amplia aplicación: es adecuado para la extracción en un solo paso de ADN genómico de la cola, oreja, dedo del pie y otros tejidos de ratón.
■ Alta especificidad: la polimerasa Taq utilizada en este producto es una enzima de inicio en caliente modificada por anticuerpos, con alta afinidad de molde y cebador y especificidad de amplificación, que es especialmente adecuada para la identificación de genotipos y transgénicos.
■ Detección de genes: el producto es fácil de operar con resultados confiables y es especialmente adecuado para análisis de alto rendimiento y detección de tejidos de ratón.

Todos los productos se pueden personalizar para ODM / OEM. Para detalles,haga clic en Servicio personalizado (ODM / OEM)

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Experimental Example

Usando el kit Mouse Tissue Direct PCR y el producto relevante del proveedor A para amplificar fragmentos de 1000 bp, 2000 bp y 3000 bp de la cola de ratón, la oreja de ratón y la cola de rata, respectivamente. El resultado mostró que Mouse Tissue Direct PCR Kit tiene mejor especificidad y tasa de éxito.

P: sin bandas de amplificación

Plantilla A-1

■ La plantilla contiene impurezas de proteínas o inhibidores de Taq, etc. —Purifique la plantilla de ADN, elimine las impurezas de proteínas o extraiga el ADN de la plantilla con kits de purificación.

■ La desnaturalización de la plantilla no es completa —— Aumente adecuadamente la temperatura de desnaturalización y prolongue el tiempo de desnaturalización.

■ Degradación de la plantilla: vuelva a preparar la plantilla.

Imprimación A-2

■ Mala calidad de los cebadores: vuelva a sintetizar el cebador.

■ Degradación de la imprimación: alícuota las imprimaciones de alta concentración en un volumen pequeño para su conservación. Evite la congelación y descongelación múltiples o criopreservados a 4 ° C a largo plazo.

■ Diseño inadecuado de los cebadores (por ejemplo, la longitud del cebador no es suficiente, se forma un dímero entre los cebadores, etc.) - Rediseñe los cebadores (evite la formación del dímero del cebador y la estructura secundaria)

A-3 Mg²⁺concentración

■ Mg²⁺ la concentración es demasiado baja —— Aumente adecuadamente el Mg²⁺concentración: Optimice el Mg²⁺ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo²⁺ concentración para cada plantilla y cebador.

A-4 Temperatura de recocido

■ La alta temperatura de recocido afecta la unión del cebador y la plantilla. ——Reducir la temperatura de recocido y optimizar la condición con un gradiente de 2 ° C.

A-5 Tiempo de extensión

■ Tiempo de extensión corto —— Aumente el tiempo de extensión.

P: falso positivo

Fenómenos: las muestras negativas también muestran las bandas de la secuencia objetivo.

A-1 Contaminación de PCR

■ Contaminación cruzada de la secuencia diana o los productos de amplificación —— Tenga cuidado de no pipetear la muestra que contiene la secuencia diana en la muestra negativa ni derramarla fuera del tubo de centrífuga. Los reactivos o el equipo deben esterilizarse en autoclave para eliminar los ácidos nucleicos existentes, y la existencia de contaminación debe determinarse mediante experimentos de control negativo.

■ Contaminación de los reactivos ——Aliquiar los reactivos y almacenar a baja temperatura.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ la concentración es demasiado baja —— Aumente adecuadamente el Mg²⁺ concentración: Optimice el Mg²⁺ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo²⁺ concentración para cada plantilla y cebador.

■ Diseño de cebador inadecuado y la secuencia objetivo tiene homología con la secuencia no objetivo. —— Rediseño de imprimaciones.

P: amplificación no específica

Fenómenos: Las bandas de amplificación por PCR no son coherentes con el tamaño esperado, ya sea grande o pequeño, o en ocasiones se producen tanto bandas de amplificación específicas como bandas de amplificación no específicas.

Imprimación A-1

■ Pobre especificidad del cebador

—— Imprimación de rediseño.

■ La concentración de imprimación es demasiado alta —— Aumente adecuadamente la temperatura de desnaturalización y prolongue el tiempo de desnaturalización.

A-2 Mg²⁺ concentración

■ El Mg²⁺ la concentración es demasiado alta —— Reduzca adecuadamente la concentración de Mg2 +: Optimice la concentración de Mg²⁺ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo²⁺ concentración para cada plantilla y cebador.

Polimerasa termoestable A-3

■ Cantidad excesiva de enzimas: reduzca la cantidad de enzimas de manera adecuada a intervalos de 0,5 U.

A-4 Temperatura de recocido

■ La temperatura de recocido es demasiado baja —— Aumente adecuadamente la temperatura de recocido o adopte el método de recocido de dos etapas

Ciclos de PCR A-5

■ Demasiados ciclos de PCR: reduzca el número de ciclos de PCR.

P: bandas parcheadas o manchadas

Imprimación A-1—— Escasa especificidad —— Rediseñe el cebador, cambie la posición y la longitud del cebador para mejorar su especificidad; o realizar una PCR anidada.

Plantilla de ADN A-2

——La plantilla no es pura ——Purifique la plantilla o extraiga el ADN con kits de purificación.

A-3 Mg²⁺ concentración

——Mg²⁺ la concentración es demasiado alta —— Reduzca adecuadamente el Mg²⁺ concentración: Optimice el Mg²⁺ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo²⁺ concentración para cada plantilla y cebador.

A-4 dNTP

——La concentración de dNTP es demasiado alta —— Reducir la concentración de dNTP de forma adecuada

A-5 Temperatura de recocido

——Temperatura de recocido demasiado baja —— Aumente adecuadamente la temperatura de recocido

Ciclos A-6

——Demasiados ciclos ——Optimizar el número de ciclo

P: ¿Cuánto ADN molde se debe agregar en un sistema de reacción de PCR de 50 μl?

P: ¿Cómo amplificar fragmentos largos?

El primer paso es elegir la polimerasa adecuada. La polimerasa Taq regular no se puede corregir debido a la falta de actividad exonucleasa 3'-5 ', y el desajuste reducirá en gran medida la eficacia de extensión de los fragmentos. Por lo tanto, la polimerasa Taq regular no puede amplificar eficazmente fragmentos diana mayores de 5 kb. Se debe seleccionar la polimerasa Taq con modificación especial u otra polimerasa de alta fidelidad para mejorar la eficiencia de extensión y satisfacer las necesidades de amplificación de fragmentos largos. Además, la amplificación de fragmentos largos también requiere el ajuste correspondiente del diseño del cebador, el tiempo de desnaturalización, el tiempo de extensión, el pH del tampón, etc. Normalmente, los cebadores con 18-24 pb pueden conducir a un mejor rendimiento. Para evitar daños en la plantilla, el tiempo de desnaturalización a 94 ° C debe reducirse a 30 segundos o menos por ciclo, y el tiempo para aumentar la temperatura a 94 ° C antes de la amplificación debe ser inferior a 1 min. Además, establecer la temperatura de extensión en aproximadamente 68 ° C y diseñar el tiempo de extensión de acuerdo con la velocidad de 1 kb / min puede garantizar una amplificación eficaz de fragmentos largos.

P: ¿Cómo mejorar la fidelidad de amplificación de la PCR?

La tasa de error de la amplificación por PCR se puede reducir utilizando varias ADN polimerasas con alta fidelidad. Entre todas las ADN polimerasas Taq encontradas hasta ahora, la enzima Pfu tiene la tasa de error más baja y la mayor fidelidad (ver tabla adjunta). Además de la selección de enzimas, los investigadores pueden reducir aún más la tasa de mutación de la PCR optimizando las condiciones de reacción, incluida la optimización de la composición del tampón, la concentración de polimerasa termoestable y la optimización del número de ciclos de PCR.

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