Kit de PCR Blood Direct

Amplificación rápida del gen diana directamente utilizando sangre como plantilla sin extracción.

Este kit adopta una ADN polimerasa anti-inhibidor de ingeniería genética para amplificar de manera eficiente genes de copia única en el genoma humano. El sistema de tampón bien optimizado de este kit ayuda a la polimerasa a resistir fuertemente la inhibición de los inhibidores de la PCR, por lo que puede amplificar directamente el ADN utilizando sangre y células cultivadas como plantillas. Este producto es fácil de operar y no requiere pasos complicados como la purificación del ADN o el pretratamiento de la muestra.
Este kit se proporciona como 2 × MasterMix, y la reacción se puede realizar simplemente agregando la plantilla de sangre y los cebadores de detección correspondientes. Se puede aplicar sobre células cultivadas de mamíferos como humanos, ratones, cerdos, ganado y otras especies, así como sangre entera fresca o criopreservada 4 ℃, anticoagulante (EDTA, citrato, heparina), coágulos de sangre licuados y manchas de sangre seca. almacenados en tarjetas comerciales Whatman 903 y FTA Elute.

Gato. No	Tamaño de embalaje
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

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Detalle del producto

Ejemplo experimental

Preguntas más frecuentes

Etiquetas de productos

Características

■ Sencillo y rápido: la amplificación por PCR se puede realizar directamente utilizando sangre como plantilla, sin la necesidad de los tediosos pasos de preparación de muestras y extracción de ADN.
■ Alta pureza: omitir los pasos de pretratamiento de muestras y extracción de ADN puede ayudar a evitar la contaminación cruzada de las muestras.
■ Alto rendimiento: la identificación por PCR para muestras a gran escala se puede realizar combinando el kit con placas de PCR de 96/384 pocillos.
■ Fuerte universalidad: este kit puede amplificar eficientemente fragmentos de GC altos o fragmentos con estructura secundaria compleja, y la longitud de amplificación puede ser de hasta 5 kb.
■ Fuerte resistencia al estrés: este kit se puede aplicar a varias especies y muestras de sangre conservadas de diferentes formas.

Aplicaciones

Los productos de PCR de este kit contienen "A" en el extremo 3 ', que se puede utilizar directamente para la clonación del vector TA. Este kit se puede utilizar para la amplificación de fragmentos de ADN genómico, análisis genético de alto rendimiento y análisis de genotipado (como detección de genes).

Todos los productos se pueden personalizar para ODM / OEM. Para detalles,haga clic en Servicio personalizado (ODM / OEM)

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	Utilizando anticoagulación con EDTA humano como plantilla, se amplificaron 4 genes con diferentes contenidos de GC mediante Blood Direct PCR Kit. El sistema de reacción de PCR fue de 20 µl y se utilizó 1 µl de sangre como molde. M: marcador II de TIANGEN; 1: Tamaño de fragmento 1090 pb, contenido de GC 68,1%; 2: Tamaño de fragmento 1915 pb, contenido de GC 70,4%; 3: Tamaño de fragmento 448 pb, contenido de GC 74,8%; 4: Tamaño de fragmento 1527 pb, contenido de GC 61,5%. Resultados experimentales: Blood Direct PCR Kit puede amplificar de manera eficaz fragmentos de ADN con un contenido de GC en el rango de 61,5% a 74,8%, lo que sugiere que es capaz de amplificar fragmentos de alta GC.
	Utilizando anticoagulación con EDTA humano como molde, se amplificaron 5 genes con diferentes longitudes (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 y Hn4.0) mediante Blood Direct PCR Kit. El sistema de reacción de PCR fue de 20 µl y se utilizó 1 µl de sangre como molde. M: marcador II de TIANGEN; 1-3: 3 muestras de sangre diferentes; NTC: control sin imprimaciones. Resultados experimentales: Blood Direct PCR Kit puede amplificar fragmentos con una longitud de hasta 4 kb, lo que sugiere que es capaz de amplificar fragmentos largos.
	Utilizando anticoagulación con EDTA humano como molde, se utilizó el kit Blood Direct PCR para la detección por PCR de diferentes muestras de sangre. El sistema de reacción de PCR fue de 20 µl y se utilizó 1 µl de sangre como molde. M: marcador II de TIANGEN; 1-9: la cantidad de sangre de carga es 0,1 µl, 0,2 µl, 0,3 µl, 0,4 µl, 1 µl, 2 µl, 3 µl, 4 µl y 5 µl, respectivamente; NTC: control sin plantilla Resultados experimentales: Blood Direct PCR Kit tiene una fuerte resistencia a la sangre y puede amplificar muestras de sangre con un rango de carga de 0,1-5 μl.
	Se utilizaron como plantillas muestras de sangre de humanos, ratas, pollos y otras especies con diferentes tratamientos. El kit Blood Direct PCR se utilizó para amplificar PRNP (humano, 750 pb), actina (rata, 200 pb) y β-actina (pollo, 1,0 kb). El sistema de reacción de PCR fue de 20 µl y se utilizó 1 µl de sangre como molde. M: Marcador TIANGEN II. Resultados experimentales: Blood Direct PCR Kit se puede aplicar en una amplia gama de muestras, y la detección directa de PCR se puede realizar en muestras de sangre de varias especies con diferentes tratamientos.

P: sin bandas de amplificación

Plantilla A-1

■ La plantilla contiene impurezas de proteínas o inhibidores de Taq, etc. —Purifique la plantilla de ADN, elimine las impurezas de proteínas o extraiga el ADN de la plantilla con kits de purificación.

■ La desnaturalización de la plantilla no es completa —— Aumente adecuadamente la temperatura de desnaturalización y prolongue el tiempo de desnaturalización.

■ Degradación de la plantilla: vuelva a preparar la plantilla.

Imprimación A-2

■ Mala calidad de los cebadores: vuelva a sintetizar el cebador.

■ Degradación de la imprimación: alícuota las imprimaciones de alta concentración en un volumen pequeño para su conservación. Evite la congelación y descongelación múltiples o criopreservados a 4 ° C a largo plazo.

■ Diseño inadecuado de los cebadores (por ejemplo, la longitud del cebador no es suficiente, se forma un dímero entre los cebadores, etc.) - Rediseñe los cebadores (evite la formación del dímero del cebador y la estructura secundaria)

A-3 Mg²⁺concentración

■ Mg²⁺ la concentración es demasiado baja —— Aumente adecuadamente el Mg²⁺concentración: Optimice el Mg²⁺ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo²⁺ concentración para cada plantilla y cebador.

A-4 Temperatura de recocido

■ La alta temperatura de recocido afecta la unión del cebador y la plantilla. ——Reducir la temperatura de recocido y optimizar la condición con un gradiente de 2 ° C.

A-5 Tiempo de extensión

■ Tiempo de extensión corto —— Aumente el tiempo de extensión.

P: falso positivo

Fenómenos: las muestras negativas también muestran las bandas de la secuencia objetivo.

A-1 Contaminación de PCR

■ Contaminación cruzada de la secuencia diana o los productos de amplificación —— Tenga cuidado de no pipetear la muestra que contiene la secuencia diana en la muestra negativa ni derramarla fuera del tubo de centrífuga. Los reactivos o el equipo deben esterilizarse en autoclave para eliminar los ácidos nucleicos existentes, y la existencia de contaminación debe determinarse mediante experimentos de control negativo.

■ Contaminación de los reactivos ——Aliquiar los reactivos y almacenar a baja temperatura.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ la concentración es demasiado baja —— Aumente adecuadamente el Mg²⁺ concentración: Optimice el Mg²⁺ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo²⁺ concentración para cada plantilla y cebador.

■ Diseño de cebador inadecuado y la secuencia objetivo tiene homología con la secuencia no objetivo. —— Rediseño de imprimaciones.

P: amplificación no específica

Fenómenos: Las bandas de amplificación por PCR no son coherentes con el tamaño esperado, ya sea grande o pequeño, o en ocasiones se producen tanto bandas de amplificación específicas como bandas de amplificación no específicas.

Imprimación A-1

■ Pobre especificidad del cebador

—— Imprimación de rediseño.

■ La concentración de imprimación es demasiado alta —— Aumente adecuadamente la temperatura de desnaturalización y prolongue el tiempo de desnaturalización.

A-2 Mg²⁺ concentración

■ El Mg²⁺ la concentración es demasiado alta —— Reduzca adecuadamente la concentración de Mg2 +: Optimice la concentración de Mg²⁺ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo²⁺ concentración para cada plantilla y cebador.

Polimerasa termoestable A-3

■ Cantidad excesiva de enzimas: reduzca la cantidad de enzimas de manera adecuada a intervalos de 0,5 U.

A-4 Temperatura de recocido

■ La temperatura de recocido es demasiado baja —— Aumente adecuadamente la temperatura de recocido o adopte el método de recocido de dos etapas

Ciclos de PCR A-5

■ Demasiados ciclos de PCR: reduzca el número de ciclos de PCR.

P: bandas parcheadas o manchadas

Imprimación A-1—— Escasa especificidad —— Rediseñe el cebador, cambie la posición y la longitud del cebador para mejorar su especificidad; o realizar una PCR anidada.

Plantilla de ADN A-2

——La plantilla no es pura ——Purifique la plantilla o extraiga el ADN con kits de purificación.

A-3 Mg²⁺ concentración

——Mg²⁺ la concentración es demasiado alta —— Reduzca adecuadamente el Mg²⁺ concentración: Optimice el Mg²⁺ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo²⁺ concentración para cada plantilla y cebador.

A-4 dNTP

——La concentración de dNTP es demasiado alta —— Reducir la concentración de dNTP de forma adecuada

A-5 Temperatura de recocido

——Temperatura de recocido demasiado baja —— Aumente adecuadamente la temperatura de recocido

Ciclos A-6

——Demasiados ciclos ——Optimizar el número de ciclo

P: ¿Cuánto ADN molde se debe agregar en un sistema de reacción de PCR de 50 μl?

P: ¿Cómo amplificar fragmentos largos?

El primer paso es elegir la polimerasa adecuada. La polimerasa Taq regular no se puede corregir debido a la falta de actividad exonucleasa 3'-5 ', y el desajuste reducirá en gran medida la eficacia de extensión de los fragmentos. Por lo tanto, la polimerasa Taq regular no puede amplificar eficazmente fragmentos diana mayores de 5 kb. Se debe seleccionar la polimerasa Taq con modificación especial u otra polimerasa de alta fidelidad para mejorar la eficiencia de extensión y satisfacer las necesidades de amplificación de fragmentos largos. Además, la amplificación de fragmentos largos también requiere el ajuste correspondiente del diseño del cebador, el tiempo de desnaturalización, el tiempo de extensión, el pH del tampón, etc. Normalmente, los cebadores con 18-24 pb pueden conducir a un mejor rendimiento. Para evitar daños en la plantilla, el tiempo de desnaturalización a 94 ° C debe reducirse a 30 segundos o menos por ciclo, y el tiempo para aumentar la temperatura a 94 ° C antes de la amplificación debe ser inferior a 1 min. Además, establecer la temperatura de extensión en aproximadamente 68 ° C y diseñar el tiempo de extensión de acuerdo con la velocidad de 1 kb / min puede garantizar una amplificación eficaz de fragmentos largos.

P: ¿Cómo mejorar la fidelidad de amplificación de la PCR?

La tasa de error de la amplificación por PCR se puede reducir utilizando varias ADN polimerasas con alta fidelidad. Entre todas las ADN polimerasas Taq encontradas hasta ahora, la enzima Pfu tiene la tasa de error más baja y la mayor fidelidad (ver tabla adjunta). Además de la selección de enzimas, los investigadores pueden reducir aún más la tasa de mutación de la PCR optimizando las condiciones de reacción, incluida la optimización de la composición del tampón, la concentración de polimerasa termoestable y la optimización del número de ciclos de PCR.

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