2 × Taq Platinum PCR Mix
Definición de actividad
1 unidad (U) de actividad Taq Platinum ADN polimerasa se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 10 nmol de desoxinucleótidos en sustancias insolubles en ácido a 74 ° C en 30 minutos utilizando ADN de esperma de salmón activado como plantilla / cebador.
Control de calidad
La pureza por detección de SDS-PAGE es más del 99%; No se detecta actividad de nucleasa exógena; El gen de copia única en el genoma humano podría amplificarse eficazmente; No hay cambios de actividad significativos cuando se almacena a temperatura ambiente durante una semana.
Parámetros técnicos principales
Tiene actividad exonucleasa 5′-3 ′ y actividad exonucleasa 3′-5 ′, y su fidelidad es próxima a la polimerasa Pfu. La velocidad de extensión de Taq Platinum Polymerase es más rápida que la de Pfu polimerasa y la eficiencia de amplificación es mayor. Los productos de la PCR pueden ligarse directamente al extremo romo o clonarse con el vector TA. Si es necesario mejorar la eficacia de la clonación, se recomienda purificar primero y añadir salientes de 3'-dA antes de la clonación en el vector TA.
Taq Platinum MasterMix de un tubo (certificación nacional de productos de alta tecnología)
■ Taq Platinum MasterMix ha mejorado la especificidad y sensibilidad de la reacción de PCR y puede amplificar plantillas complejas con alto contenido de GC, estructura secundaria y similares. Se pueden amplificar tan solo 2 copias de la plantilla objetivo, lo que garantiza resultados experimentales más precisos.
■ La fórmula única de Taq Platinum MasterMix hace que todo el sistema de reacción sea muy estable y la actividad no se verá afectada por la congelación-descongelación repetida o el almacenamiento prolongado a 4 ° C.
■ La solución mixta de PCR preparada previamente, estable y eficiente, puede hacer que la operación sea rápida y simple, reduciendo en gran medida la intensidad del trabajo y los errores de muestreo. El potenciador y optimizador de PCR de alto rendimiento también se incluyen en la mezcla, lo que reduce los requisitos en las condiciones de PCR.
■ Este producto tiene sistemas que contienen y sin colorantes. Los productos MasterMix que contienen colorantes pueden someterse a electroforesis directamente después de la PCR, sin añadir tampón de carga.
Aplicaciones
Puede reemplazar la polimerasa Pfu para amplificar productos de alta fidelidad a partir de plantillas complejas como genomas, y es adecuado para aplicaciones como la clonación de genes de expresión, mutaciones específicas de sitio y análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), etc.
Precauciones en el diseño de cebadores de PCR:
La longitud de la imprimación suele ser de 20 a 25 unidades. Sin embargo, cuando se realiza una PCR de fragmentos largos, la longitud del cebador debe aumentarse a 30-35 mer.
■ No hay emparejamiento complementario entre los dos cebadores, especialmente para las últimas 3 bases en el extremo 3 ′.
■ El contenido de GC debe ser del 50-60% y evitar GC o AT locales ricos. Para hacer que el cebador y el molde se unan de manera estable, evite la estructura rica en AT en el extremo 3 '.
■ Evite que la imprimación forme una estructura secundaria.
■ Seleccione dos cebadores con temperaturas Tm próximas entre sí.
Cálculo del valor de Tm de los cebadores para PCR:
■ Cuando la imprimación es inferior a 20 mer: Tm = 2 ° C × (A + T) + 4 ° C × (G + C).
■ Cuando la imprimación es más de 20 mer: Tm = 81,5 + 0,41 × (GC%) - 600 / L, donde L es la longitud de la imprimación.
■ Establezca la temperatura de recocido en (Tm-5) ° C.
Entrada de cebador de PCR
La concentración final apropiada de cebadores se puede seleccionar entre 0,1 µM y 1,0 µM. Una concentración de cebador demasiado baja conduce a un bajo rendimiento de productos de amplificación, mientras que una concentración de cebador demasiado alta es más propensa a una amplificación inespecífica. Por lo general, cuando la cantidad de ADN molde es grande o se usa ADN molde complejo (como el ADN del genoma humano) como molde, la concentración de cebador debe ser menor. Cuando la cantidad de ADN molde es pequeña o se usa ADN molde simple (por ejemplo, ADN plasmídico, etc.) como molde, la concentración de cebador debería ser mayor.
Todos los productos se pueden personalizar para ODM / OEM. Para detalles,haga clic en Servicio personalizado (ODM / OEM)
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Utilice ADN genómico como plantilla para amplificar el fragmento de 1 kb. Después de la reacción de PCR, tome 5 l para la detección de electroforesis. |
Plantilla A-1
■ La plantilla contiene impurezas de proteínas o inhibidores de Taq, etc. —Purifique la plantilla de ADN, elimine las impurezas de proteínas o extraiga el ADN de la plantilla con kits de purificación.
■ La desnaturalización de la plantilla no es completa —— Aumente adecuadamente la temperatura de desnaturalización y prolongue el tiempo de desnaturalización.
■ Degradación de la plantilla: vuelva a preparar la plantilla.
Imprimación A-2
■ Mala calidad de los cebadores: vuelva a sintetizar el cebador.
■ Degradación de la imprimación: alícuota las imprimaciones de alta concentración en un volumen pequeño para su conservación. Evite la congelación y descongelación múltiples o criopreservados a 4 ° C a largo plazo.
■ Diseño inadecuado de los cebadores (por ejemplo, la longitud del cebador no es suficiente, se forma un dímero entre los cebadores, etc.) - Rediseñe los cebadores (evite la formación del dímero del cebador y la estructura secundaria)
A-3 Mg2+concentración
■ Mg2+ la concentración es demasiado baja —— Aumente adecuadamente el Mg2+ concentración: Optimice el Mg2+ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo2+ concentración para cada plantilla y cebador.
A-4 Temperatura de recocido
■ La alta temperatura de recocido afecta la unión del cebador y la plantilla. ——Reducir la temperatura de recocido y optimizar la condición con un gradiente de 2 ° C.
A-5 Tiempo de extensión
■ Tiempo de extensión corto —— Aumente el tiempo de extensión.
Fenómenos: las muestras negativas también muestran las bandas de la secuencia objetivo.
A-1 Contaminación de PCR
■ Contaminación cruzada de la secuencia diana o los productos de amplificación —— Tenga cuidado de no pipetear la muestra que contiene la secuencia diana en la muestra negativa ni derramarla fuera del tubo de centrífuga. Los reactivos o el equipo deben esterilizarse en autoclave para eliminar los ácidos nucleicos existentes, y la existencia de contaminación debe determinarse mediante experimentos de control negativo.
■ Contaminación de los reactivos ——Aliquiar los reactivos y almacenar a baja temperatura.
A-2 Primer
■ Mg2+ la concentración es demasiado baja —— Aumente adecuadamente el Mg2+ concentración: Optimice el Mg2+ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo2+ concentración para cada plantilla y cebador.
■ Diseño de cebador inadecuado y la secuencia objetivo tiene homología con la secuencia no objetivo. —— Rediseño de imprimaciones.
Fenómenos: Las bandas de amplificación por PCR no son coherentes con el tamaño esperado, ya sea grande o pequeño, o en ocasiones se producen tanto bandas de amplificación específicas como bandas de amplificación no específicas.
Imprimación A-1
■ Pobre especificidad del cebador
—— Imprimación de rediseño.
■ La concentración de imprimación es demasiado alta —— Aumente adecuadamente la temperatura de desnaturalización y prolongue el tiempo de desnaturalización.
A-2 Mg2+ concentración
■ El Mg2+ la concentración es demasiado alta —— Reduzca adecuadamente la concentración de Mg2 +: Optimice la concentración de Mg2+ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo2+ concentración para cada plantilla y cebador.
Polimerasa termoestable A-3
■ Cantidad excesiva de enzimas: reduzca la cantidad de enzimas de manera adecuada a intervalos de 0,5 U.
A-4 Temperatura de recocido
■ La temperatura de recocido es demasiado baja —— Aumente adecuadamente la temperatura de recocido o adopte el método de recocido de dos etapas
Ciclos de PCR A-5
■ Demasiados ciclos de PCR: reduzca el número de ciclos de PCR.
Imprimación A-1—— Escasa especificidad —— Rediseñe el cebador, cambie la posición y la longitud del cebador para mejorar su especificidad; o realizar una PCR anidada.
Plantilla de ADN A-2
——La plantilla no es pura ——Purifique la plantilla o extraiga el ADN con kits de purificación.
A-3 Mg2+ concentración
——Mg2+ la concentración es demasiado alta —— Reduzca adecuadamente el Mg2+ concentración: Optimice el Mg2+ concentración mediante una serie de reacciones de 1 mM a 3 mM con un intervalo de 0,5 mM para determinar el Mg óptimo2+ concentración para cada plantilla y cebador.
A-4 dNTP
——La concentración de dNTP es demasiado alta —— Reducir la concentración de dNTP de forma adecuada
A-5 Temperatura de recocido
——Temperatura de recocido demasiado baja —— Aumente adecuadamente la temperatura de recocido
Ciclos A-6
——Demasiados ciclos ——Optimizar el número de ciclo
El primer paso es elegir la polimerasa adecuada. La polimerasa Taq regular no se puede corregir debido a la falta de actividad exonucleasa 3'-5 ', y el desajuste reducirá en gran medida la eficacia de extensión de los fragmentos. Por lo tanto, la polimerasa Taq regular no puede amplificar eficazmente fragmentos diana mayores de 5 kb. Se debe seleccionar la polimerasa Taq con modificación especial u otra polimerasa de alta fidelidad para mejorar la eficiencia de extensión y satisfacer las necesidades de amplificación de fragmentos largos. Además, la amplificación de fragmentos largos también requiere el ajuste correspondiente del diseño del cebador, el tiempo de desnaturalización, el tiempo de extensión, el pH del tampón, etc. Normalmente, los cebadores con 18-24 pb pueden conducir a un mejor rendimiento. Para evitar daños en la plantilla, el tiempo de desnaturalización a 94 ° C debe reducirse a 30 segundos o menos por ciclo, y el tiempo para aumentar la temperatura a 94 ° C antes de la amplificación debe ser inferior a 1 min. Además, establecer la temperatura de extensión en aproximadamente 68 ° C y diseñar el tiempo de extensión de acuerdo con la velocidad de 1 kb / min puede garantizar una amplificación eficaz de fragmentos largos.
La tasa de error de la amplificación por PCR se puede reducir utilizando varias ADN polimerasas con alta fidelidad. Entre todas las ADN polimerasas Taq encontradas hasta ahora, la enzima Pfu tiene la tasa de error más baja y la mayor fidelidad (ver tabla adjunta). Además de la selección de enzimas, los investigadores pueden reducir aún más la tasa de mutación de la PCR optimizando las condiciones de reacción, incluida la optimización de la composición del tampón, la concentración de polimerasa termoestable y la optimización del número de ciclos de PCR.
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